واكنش زنجيره پليمراز PCR
مسئله اصلي در بررسي يك ژن خاص مشكل هدف گيري آن در يك ژنوم پيچيده كه ممكن است بيش از صد هزار ژن داشته باشد است. بسياري از روشها در ژنتيك ملكولي به اين مشكل فائق‌آمده‌اند. تكنيكPCR در اواسط دههِ 1980 در دپارتمان ژنتيك انساني بوسيلهِKaru Mullis ابداع‌و براي تكثير ژن كم خوني داسي شكل و بتاگلوبين انساني مورد استفاده قرار گرفتSaiki(1985) از پژوهشگران شركت مهندسي ستوساشكالات موجود را رفع كرد وروش متداول كنوني را ابداع نمود.
حقوق تجاري اين اختراع اينك به شركت هافمن - روچت تعلق داردKaru Mullis در سال 1993 موفق به كسب جايزهِ نوبل شيمي گرديد. واكنش زنجيرهِ پلي مراز يك‌روش آزمايشگاهي است كه به منظور توليد انبوه قطعه خاص و انتخابي ازDNA به كار مي‌رود.واكنش مبتني بر تكثير آنزيمي قطعه‌اي ازDNA است كه با استفاد از دو آغازگر چند نوكلئوتيدي كه مكمل پايانهِ َ5 هر دو رشته مورد نظر هستند، صورت مي‌گيرد تا كپي شدن الگويDNA توسط آنزيم پليمراز امكان‌پذير شود در سال 1985 تنها سه مقاله علمي در زمينهPCR گزارش شده بود. پنج سال بعد از آن اين روش در هزاران آزمايشگاه استفاده گرديد و تاكنون هزاران‌مقاله و دهها كتاب مستقل به اين موضوع اختصاص داده شده است به گونه‌اي كه دانشگاه آكسفوردحتي مجله‌اي به نامPCR منتشر مي‌سازد .
به عقيده بيولوژيستهاPCRوسيله‌اي است كه سوزني را در كوهي از كاه پيدا مي‌كند.PCR از نظر اصولي عملي تشابه زيادي به همانند سازيDNA دارد و در واقع برگرفته از آن است‌بطوركلي دو فرق بينPCR و همانندسازي وجود دارد: همانند سازي در بدن در دمايc 37با آنزيمDNA پلي مراز و آنزيمهاي ديگر صورت مي‌گيرد درPCRبه علت نياز به درجه حرارت بالا جهت‌واسرشت شدن از آنزيم مقاوم به حرارت همانندTaqاستفاده مي‌شود و به جاي ساير آنزيمها ازتغييرات درجه حرارت استفاده مي‌شود.
مقايسه تكثير ژن از طريق كلونينگ باPCR
- در كلونينگ هفته‌ها يا ماهها وقت براي تكثير قطعهDNA لازم است، در حاليكه درPCR قطعات خاصDNA از ژنومي پيچيده، ظرف چند ساعت بدست مي‌آيد.
- درPCRمقادير بسيار كمي ازDNAبراي تكثير موردنياز است درحاليكه در روشهاي استاندارد كلونينگ وتجزيه وتحليلهاي بيولوژي ملكولي به چند ميليون قطعه ازDNAاحتياج است.
- براي كلون كردن،DNAتا حد امكان بايد خالص باشد ولي برايPCR خلوصDNAاهميت زيادي ندارد
- تكثيرDNAدرPCRدر محيط عاري از سلول صورت مي‌گيرد ولي كلونينگ به سلولهاي زنده نياز دارد.
- يكي از مزايايPCR سرعت آن است پليمرازTaqمي‌تواند توالي‌هايي متجاوز از هزارجفت باز را در ظرف مدت كمتر از يك دقيقه تكثير نمايد.
- درPCRنيازي به جدا كردن قطعه مورد نظر از محل استقرارش در DNAنمي‌باشدحاليكه اين محدوديت در روشهاي كلونينگ وجود دارد.
اصول و مبانيPCR
واكنش زنجيره پليمراز مبتني بر تكثير آنزيمي قطعه‌اي ازDNA است كه با استفاده ازآغازگر صورت مي‌گيرد. طول آغازگر بايستي به اندازهِ كافي بزرگ باشد تا تواليهاي مشابه به آنها درنواحي غير هدف يافت نگردد پرايمرها دو عمل را انجام مي‌دهند.اندازه قطعات تكثير شونده را مشخص مي‌كنند،محل ژني كه بايد تكثير شود را مشخص مي‌كنند.بعد از اتصال آغازگر به مكملهاي خود در توالي هدف، انتهاي هيدروكسيل َ3 آنها رو به سوي ناحيه هدف قرار مي‌گيرد.
PCR طي سه دورهِ متوالي واسرشت سازيرشتهِ الگو، اتصال آغازگر و بسط توسط آنزيم پليمراز انجام مي‌گيرد.
در چرخه اول و دوم فرآوردهِ حاصل از بسط داراي طول مشخصي نيست. در چرخه سوم قطعاتي ساخته مي‌شود كه طول آنها مشخص است از چرخهِ چهارم تكثير به صورت نمائي است
پارامترهاي سيكلي
روشPCR بطوردستي (بوسيله حمام آبي) و هم بطور اتوماتيك و با ترموسايكلر صورت مي‌گيرد. ابتدا با حرارت 90-94(در30 ثانيه) دو رشتهDNA از يكديگر جدا مي‌شود و سپس بامختصري برودتc 30-65بمدت (30ثانيه) پرايمرها به مكملهاي خود درروي رشتهDNA متصل‌مي‌شوند وبه دنبال آن با رساندن دما به 57-70(5-2 دقيقه) شرايط براي گسترش پرايمرهاي‌چسبيده بوسيلهِ آنزيم تك پليمراز فراهم مي‌شود.زمان شيب حرارتي يا زماني كه درجه‌حرارت از مقداري به مقدار ديگر عوض مي‌شود بستگي به نوع دستگاه به كار برده شده دارد براي‌اطمينان از اينكه نمونه‌ها به درجه حرارت مورد نظر رسيده‌اند مدت زمان پرش حرارتي بوسيلهِاندازه‌گيري ترمومتر نمونه درطي يك آزمايش تكثيرانجام مي‌شود .گرماي غيركافي درطي‌مرحله واسرشت يكي ازعلتهائي است كه باعث شكست در واكنشPCR مي‌گردد
استخراجDNA برايPCR
نقطهِ شروع بسياري از روشهاي بيولوژي مولكولي ضرورت جداسازيDNAبا كيفيت عالي است. معمولا كيفيتDNA با عواملي از قبيل عدم آلودگي ناشي ازRNA، پروتئين، ليپيد و سايرساختارهائي كه براي آنزيمهاي برشي و پلي مرازها مزاحمت ايجاد مي‌كنند سنجيده مي‌شود. به‌علت بزرگ بودن اندازهِDNAومي در پستانداران، روشهاي استخراجDNA بايد حداقل استرس‌مكانيكي را در طي استخراج ايجاد نمايند.معمولإ روشهائي كه در آنها چندين شوينده همچونSDS وtritonX100 استفاده مي‌شود.
كه نقش آنها ليز نمودن سلول و كمك به از بين بردن پروتئين متصل بهDNA مي‌باشد. پروتئين‌زدائي‌بيشتر از طريق پروتيئنازK صورت مي‌گيرد كه اين ماده در بافر ليز كننده مورد استفاده قرار مي‌گيرد.اين آنزيم در حضورSDSدر دمايc 56-65 فعاليت دارد تحت اين شرايط پروتئين بهتر واسرشت‌مي‌شود برعكس در همين شرايط آنزيمهاي ديگر مثلDNAase دناتوره مي‌شود.متعاقب استفاده از پروتيئنازKاز ايزوپروپانول براي از بين بردن موِثر پروتئين‌ها استفاده مي‌شود و باقيمانده پروتئين و ليپيد نيز بطور موِثر از طريق كاربرد فنل و كلروفورم از بين مي‌رودآلودگيRNA از طريق تيمار كردن نمونه با RNAase از بين مي‌رود.در روشهاي ديگر بعد از پروتئينازK از نمك اشباع براي رفع آلودگي پروتئين استفاده مي‌شود در استخراجDNA از هپارين برايPCR بهتر است استفاده نشود چون هپارين از فعاليتTaq پليمراز جلوگيري مي‌كند .وجودEDTAحداقلmM 2در بافر استخراج باعث مي‌شود كه كوانزيمهاي آنزيمAase DNباEDTAشلات شود و از تجزيه تصادفيDNAجلوگيري نمايد.
تعداد سيكلPCR :
بعضي از راهنمايي‌ها براي تعداد سيكلها در مقابل غلظت الگوي آغازي چنين پيشنهاد شدهاست.
طراحي آغازگر:
قواعد مشخصي براي اينكه بتوان با اطمينان يك جفت پرايمر موِثر را انتخاب كرد وجودندارد. در حال حاضر پرايمر بيش از هر عامل ديگري عامل موفقيت يا شكست در يك واكنش‌تكثيري است. بعضي قواعد راهنمايي‌هاي مفيدي را در مورد طراحي آغازگر مي‌كنند كه ذيلاإ به آنهااشاره شده است.
- طول متوسط هر پرايمر بين 18- 30جفت باز پرايمر با طول كوچك اتصال غيراختصاصي را افزايش و پرايمر بزرگتر سرعت هيبريداسيون را كم مي‌كند
مقدارG-C دو پرايمر با هم مشابه بوده و حدود 50-60 درصد باشد.
- آغازگرها را بايد از نظر مكمل بودن با هم كنترل شوند.
پرايمر دايمر يا آغازگر دوتائي يك تكثير مصنوعي است كه اغلب در محصولPCR مشاهده مي‌شود و عبارتست از يك قطعهِ دو رشته‌اي كه طول آن تقريبا به مجموع دو پرايمر نزديك است وهنگامي مشاهده مي‌شود كه يك پرايمر توسط آنزيم پليمراز به روي پرايمر ديگر گسترش يابدمكانيزم واقعي كه چگونه پرايمر دايمر تشكيل مي‌شود بدرستي مشخص نيست. پرايمرها با انتهاي‌مكمل َ3 مستعد تشكيل دايمر هستند. ضعف در آنزيمTaq باعث پليمريزاسيون مستقيم الگوي‌غيرهدف شود. در هر حال چنانچه پرايمر دايمر بعنوان مانعي مشاهده شوند مي‌توان آن را تاحدودي با غلظت حداقل پرايمر و آنزيم كاهش داد.
- در انتهاي َ3 پرايمر بايد حداقلC ياGقرار گيرد در توالي‌هائي پرايمرهائي كه انتهاي َ3 آنها غني‌ا زG+C مي‌باشد احتمال اتصال اشتباهي افزايش مي‌يابد
- بايد تا حد امكان از تواليهاي پاليندروميك داخل پرايمرها جلوگيري كرد.
- نسبت چهار نوكلئوتيد در آغازگر حتي‌المقدور يكسان باشد.
- آغازگر به توالي تكرار شونده ختم نشود.
- دمايTm دو آغازگر نزديك هم باشد .
- حدمجاز دماي اتصال پرايمر طراحي شده‌بايد بين 65-55 باشد. دماي تكثيرايده‌آل 62-72مي‌باشد.
درجه حرارتي كه پرايمر بهDNA الگو متصل مي‌شود به طول آغازگر و مقدارGC آن بستگي دارد براي پرايمرهاي حاوي GC 50% و داراي 20 نوكلئوتيد، دماي 55 درجه‌سانتيگراد پيشنهادمي‌شود براي افزايش اختصاصي عمل كردن آغازگر حتي ممكن است دماهاي بالاتري هم موردنيازباشد.
براي اينكه هر پرايمر با رشته الگوي خودش هيبريد شود لازم نيست كه عينا و كاملا مكمل رشتهِ الگو باشد براي طراحي پرايمر اغلب از برنامه‌هاي كامپيوتري ويژه استفاده مي‌شود فاصله بين‌پرايمرهايي كه باDNAي هدف هيبريد مي‌شود بطور معمول كمتر از 15 كيلو باز مي‌باشد.در حقيقت يك كاهش اساسي در سنتز موِثر هنگامي كه محصول تكثير متجاوز ا زb 1000مي‌شود، مشاهده مي‌گردد. به همين دليل طول قطعه مورد تكثير درPCRنبايد بيش ازKb3 باشد وحدمطلوب كمتر ازKb1مي‌باشد تكثير قطعات بسيار طويل و بالايKb 40 مقدور است اما نياز به روشهاي ويژه‌اي دارد.
دماي ذوب آغازگر
دماي اتصال بايد بقدر كافي پايين باشد تا پرايمر وDNA الگو قادر به اتصال باشند و از سوي ديگر بايد به قدر مناسب بالا باشد تا از تشكيل اتصالات غيراختصاصي جلوگيري كند. دماي اتصال‌از روي شاخصي به نام درجه حرارت ذوب محاسبه مي‌شود. دماي ذوب درجه حرارتي است كه درآن نيمي از DNAبه صورت تك رشته‌اي درآمده است. يكي از مهمترين مشخصاتTm وابستگي آن به تركيب بازيDNA استG. وC سه پيوند هيدروژني و بازهاي آدنين و تيمين دوپيوند هيدروژني دارند. بنابراين هر چقدر مقدار گوانين و سيتوزين درDNAبيشتر باشدTmبيشتراست. دماي 2-1 درجه سانتيگراد كمتر ازTmكافيست كه هيبريداسيون بين پرايمر وDNAي الگودر آن صورت گيرد. دماي ذوب بطور معمول از طريق فرمول سادهِ زير نيز محاسبه مي‌شود.
c 0Tm = ]4 * (G + C) + 2 * (A + T) براي هر پرايمر 20 نوكلئوتيدي
دو پرايمر بايد طوري طراحي شوند كه دارايTm يكسان باشند در غير اينصورت درحرارت مناسب براي يك پرايمر براي جفت ديگر نامناسب خواهد بود.بسياري از آزمايشگاهها دماي چسبيدن را از 5-3 درجه سانتيگراد زير دماي ذوب(Tm) كه طريق اين فرمول محاسبه شدهاست درنظر مي‌گيرند. از اين موضوع نتيجه گرفته مي‌شود كه‌پرايمرهاي با طول زياد باعث افزايش بالا رفتن اختصاصي بودن واكنش نمي‌شود.
بعضي از محققين رابطه زير را براي محاسبهTm پرايمر بكار مي‌برند.
(FA) 36/0/L) - 005(G + C) - ( 114/0 ]j+[ + 01Log)6/61 + 5/18Tm =
Kcl غلظت كاتيون منو و لنتj=
طول اليگو نوكلئوتيدL=
فرماميد كه يك افزايندهِPCRاستFA =
بطور معمولPCR در غياب فرماميد انجام مي‌شود بنابراين مي‌توان آن را از آخر فرمول حذف كرد. اين فرمول براي پرايمرهاي 07-41 بازي مناسب است.فرمول ديگر براي محاسبهTm پرايمر براي نوكلئوتيدهايbp 20-35 مناسب مي‌باشدبصورت زير است.
(Ln) 64/1 + 22Tp =
كه در آن( G + C ) + ( A + T ) = Ln 2 طول پرايمر وTPدماي مناسب اتصال اس
غلظت پرايمرها و روش اندازه‌گيري آن
غلظت پرايمر بين 50/0 تا 5/0 ميكرومول و حد مطلوب 6/0 - 1/0 براي يك واكنش25 ميكروليتري مي‌باشد. غلظت بالاي پرايمر باعث بسط غيراختصاصي و پرايمر- دايمر مي‌شود.بعضي از منابع روش زير را براي محاسبه غلظت پرايمر پيشنهاد كرده‌اند‌‌‌‌براي انجام اين محاسبه ابتدا لازمست كه ضريب تكثير مولي پرايمر در 260 نانومتر محاسبه شود كه غلظت مولي مي‌تواند با استفاده از فرمول زير محاسبه شود.روش ديگر محاسبه براساسOD 4مي‌باشد.
اتصال پرايمر
دما و مدت زمان لازم براي اتصال پرايمر به: 1) طول پرايمر، 2) تركيب نوكلئوتيد3) غلظت پرايمر بستگي دارد.با توجه به طيف فعاليت آنزيمTaq پليمراز كه در محدوده 58-02 درجه سانتيگراد مي‌باشددماي اتصال در محدودهِ 72-55 درجه سانتيگراد بطور معمول بهترين نتيجه را مي‌دهد افزايش‌دماي اتصال بسط غيراختصاصي را در انتهاي َ3 پرايمر كاهش مي‌دهد. دماي پايين تكثير همراه باغلظت اختصاصي بودن واكنش را كاهش مي‌دهد
بسط پرايمر
مدت زمان بسط بستگي به عوامل: 1) طول توالي هدف، 2) غلظت توالي هدف و 3) دماي تكثير دارد.بسط پرايمر بطورمعمول دردماي 72 درجه سانتيگراد انجام مي‌شود يك زمان بسط دقيقه‌اي در 72 درجه سانتيگراد براي فرآورده‌هاي معادل 2 كيلو باز كافيست
بافرPCR
متداولترين بافرPCRكه همراه با تك پلي مراز استفاده مي‌شود حاوي غلظت 10 برابركه قبل از استفاده بايد به نسبت (10:1) رقيق شود اين بافر حاوي اجزاي زير است.
براي يك واكنشPCR ، غلظتTris - Cl ،mM 05-01 مي‌باشد KClبا غلظت در حدmM05را مي‌توان در مخلوط واكنش بمنظور آسان شدن اتصال پرايمر به رشته الگو اضافه كردNaCl با غلظتmM 05 ياKCl با غلظت بيش ازmM 50 اثر باز دارندگي بر روي فعاليت آنزيم تك پلي مرازدارند.
غلظت منيزيم
غلظت منيزيم در تكثير اختصاصي و نيز فعاليت آنزيمTaq پلي مراز موِثر استPCR . بايستي داراي 5/0 تا 5/2 ميلي مول منيزيم باشد حضورEDTAدر مقدار منيزيم اشكال ايجادمي‌كند غلظتMgCl2 در مخلوط نهائي واكنش مي‌تواند متغير باشد معمولاإ ميزان بهينه آن درمحدودهِ 5-5/0 ميلي مول است.يون +2Mgدو عمل انجام مي‌دهد: اول اينكه باdNTPيك تركيب قابل حل ايجاد مي‌كنند،دوم فعاليتTaq پلي مراز را تحريك مي‌كند معمولا كمبود +2Mg باعث كاهش بازده و زيادي آن باعث تكثير غيراختصاصي مي‌شود.
آنجائي كهdNTP مي‌تواند به +2Mgبچسبد، تعيين دقيق غلظت منيزيم به غلظتdNTPبستگي‌دارد در غلظت مناسب منيزيم و افزايشmM 6-4dNTP ،سرعت سنتز تك پلي مراز 30-20 درصدكاهش مي‌يابد.
دي‌اكسي نوكلئوزيدتري فسفاتهاdNTP))
dNTP به دو صورت منفرد يا مخلوطي از چهارdNTPتهيه مي‌شودpH . اكثر محلولهاياستوك باNaOHبه 5/7 رسانده مي‌شود.PCRمعمولا با غلظت حدود ميلي‌مول،dNTP100 انجام مي‌گيرد اما غلظت مناسبdNTP بستگي به غلظتMgCl2، غلظت پرايمر، طول محصول تكثير شده و تعداد سيكلهايPCRدارند. محلولهاي پايهdNTPدر 20- درجه سانتيگراد نگهداري مي‌شود. و اين محلولهاي پايهdNTP بايد تا 7pH=خنثي شود و از طريق اسپكتوفتومتر تعيين غلظت شوند.در كارهاي مولكولي توصيه مي‌شود كه در محلول كار، از هرdNTPيك ميلي مول موجودباشد براي به حداقل رساندن خطاها هرنوعdNTP بايد درغلظت‌هاي مساوي بكاربرده شوند يعني از علل بسط غيراختصاصي غلظت كمتر از يك ميكرومولdNTP يا غلظت كم يكي از بازها است‌‌‌‌تركيب دماي بالا بسط و اتصال بالاي 55 درجه و غلظت پايين 50-10 ميكرومولdNTP باشد.باعث بيشترين دقت در فرآوردهِ نهاييPCR مي‌شود
آنزيمهاي پليمراز
DNA پلي مرازها آنزيمهائي هستند كه با استفاده از منومرهاي دي‌اكسي نوكلئوزيدتري فسفات و با الگو قرار دادن رشته اصلي ساخت زنجيره پلي نوكلئوتيدي را تسريع مي‌كنند. ساختDNA معمولا از جهت َ5 بطرف َ3 است، زيرا پليمريزاسيون اغلب از 5 آلفا فسفات دزكسي‌نوكلئوتيد تري‌فسفات بطرف پايانهِ 3 گروه هيدروكسيل رشتهDNA استDNA . پلي مراز برخلافRNA پليمراز نياز به قطعهDNA كوچك يا پرايمر براي چسبيدن به توالي مكمل دارد DNA پلي مرازها قادر به تكثير قطعاتي با حداكثر 004 جفت باز مي‌باشند و در دماهاي بالاعلت حساس بودن اين آنزيم نسبت به دما بايد مرتباإ پليمراز جديدي اضافه شود. اين نحوه عمل‌سرعت و دقت عمل را پايين مي‌آورد.
DNA پليمراز تگ
حسن اين نوعDNA پلي مراز درجه حرارت بالا (59-09 درجه سانتيگراد) آن است. علاوه بر اين آنزيم تك مي‌تواند قطعاتDNA به طول 10 هزار جفت را تكثير كند.استفاده ازDNA پليمراز مقاوم به حرارت حاصل از باكتري ترموس آكواتيكوس كه منشاءچشمه آب گرم پارك ملي يلواستون مي‌باشد باعث ساده و خودكار شدن واكنش مي‌شود. پلي‌مرازهاي مقاوم در برابر حرارت موجب شده‌اند كه بسط اختصاصي فرآوردهPCR بخاطر اتصال وبسط آغازگر در دماي بالا افزايش يابد.دماي مناسب براي فعاليت اين آنزيم با توجه به الگويDNA ، برابر 80-75 درجه سانتيگراداست. در دماي 07 درجه سانتيگراد بيش از 65 نوكلئوتيد در ثانيه پلي مريزه مي‌شود.
غلظت آنزيم
غلظت توصيه شده براي تگ پليمراز بين 5/2-1 واحد در صد ميكرو ليتر واكنش توصيه شده است. در صورتيكه غلظت آنزيم بسيار بالا باشد، فرآورده‌هاي زمينه‌اي غيراختصاصي افزايش‌مي‌يابد و پايين بودن بيش از حد غلظت نيز باعث كم شدن فرآورده‌هاي مورد نظر مي‌شود. براي‌تكثيرDNAژنومي يك غلظت بهينه ازTaq معمولا حدود 4-1 واحد درصد ميكرو ليتر واكنش‌توصيه مي‌شود.
اختصاصي بودن واكنش
آنزيم مناسب و كنترل عواملي از جمله غلظت آنزيم، غلظت قطعات آغازگر، همانندسازي‌درجه حرارت دقيق و زمان نگهداري محيط عمل در يك درجه حرارت معين و تعداد چرخه در هرآزمايش همه در اختصاصي بودن واكنش اثر مي‌گذارند.بطور كلي عواملي كه در كارآييPCR ايفاي نقش مي‌كنند عبارتند از:
غلظتMgCl2 ، كيفيت و كميتDNA الگو، بافرPCR، غلظتdNTP، افزاينده‌هايPCR،بازدارنده‌هايPCR ،Nested PCR،PCR با شروع داغ، تعداد سيكلPCR و دماي اتصال‌پرايمر
مهار كننده‌ها و افزايش دهنده‌هايPCR
مواد ليست شده در جدول ذيل مي‌توانند درPCR حاوي نقش باشند.ژلاتين يا آلبومين سرم100 نانوگرم در 50 ميكروگرم واكنش‌‌‌فرماميد5%، دي‌متيل سولفوكسايد(DMSO) 01-2%پيروفسفاتاز‌‌واكنش‌واحد 100/0 – 01،تترامتيل آمونيوم كلرايد(TMAC) 001-01 ميكرومول پلي‌اتيلن گلايكول 000651-5 درصد،گليسرول5-1 درصد،توين 025/2-1 درصد،پروتئين ژن 232 نانومول،7 دي‌اَز - َ2dGTP-با 57% جايگزين،پروتئين تك رشتهDNA 1واحد،كلي‌باسيل 1 واحد، بتائين5 ميكروگرم در ميلي‌ليتر، ژلاتين يا آلبومن سرم حيواني به غلظت 100 ميكروگرم بر ميلي ليتر و شوينده غيريوني مانندتوين 02 يا Laurth-21 (1/0 تا 50/0) درصد براي ثبوت پايداري آنزيم اضافه مي‌شود.DMSO ساختمان ثانويهDNA هدف را كاهش مي‌دهد. آزمايشات نشان داد. بطور سطحي اثر بازدارندگي بر رويTaq داشته و باعث كاهش بازده كل شده است. شوينده‌هاي‌غيريوني نظيرTritonX100 و توين20 تا غلظت 5% مهار كننده نيست شوينده‌هاي يوني مانندسديم دودسيل سولفات(SDS) فقط در غلظتهاي بسيار پايين قابل تحمل است و اين شوينده باروش استخراج فنل و رسوب اتانل قبل ازPCR ازDNA حذف مي‌شود.SDS در غلظت 2-1 درصد استفاده مي‌شود در حاليكهTaq پليمراز در غلظتهاي بالاتر. 1ر0درصدSDS مهار مي‌شود.Taq پليمراز به عمل هضمي پروتيئنازK حساس است، بنابراين پروتيئنازK بايستي حذف يا غيرفعال شود. دماي 59 درجه سانتيگراد براي رسيدن به چنين هدفي كفايت مي‌كند. تيمار كردن‌حرارتي و سپس استخراج بوسيلهِ فنل پروتيئنازK را واسرشت مي‌كند. آثار باقيماندهِ فنل مي‌تواندباعث مهارPCR شود كه توسط كلروفورم حذف مي‌شود.
شروع داغ
چنانچه لازم باشد تعداد زيادي نمونهِPCR آماده گردد. ايجاد شرايط يكنواخت و مساوي براي هر تيوپ مشكل است علاوه بر اين باز و بسته كردن تيوپ براي انجام نمونه برداري‌هاي‌مختلف باعث مي‌شود كه خطر آلودگي بالا رود. بنابراين اجزاي واكنش را بطور فيزيكي با ماده‌اي كه‌بعنوان مانع بكار برده مي‌شود مي‌توان جدا كرد. هنگاميكه اين ماده در حين بالا رفتن دما ذوب‌مي‌شود آن ماده عاملي براي مخلوط شدن تمام اجزاي واكنش بطور همزمان در زمان شروعPCR مي‌باشد
به عنوان مثال در اين تكنيك اجزاي تركيب شوندهPCR به جزDNAپليمراز و الگويDNAبا همديگر مخلوط مي‌شوند. سپس يك عدد آمپلي واكس به مخلوط اضافه مي‌شود كه در80-75 درجه به مدت 10-5 دقيقه ذوب مي‌شوند سپس اجازه داده مي‌شود كه قطعه مومي خنك‌و به حالت جامد درآيد و اجزاي باقيمانده واكنش كه شاملDNA پليمراز و الگويDNA و بافرمي‌باشد بر روي قطعه مومي اضافه و تيوپها در ترموسايكلر قرار داده مي‌شوند. اگر ما موم را ذوب‌كنيم، اجزايPCR به همديگر مخلوط مي‌شود و موم به سمت بالا و در سطح مايع قرار مي‌گيرد.پس از اتمامPCR تيوپها در دماي زير 35 درجه خنك مي‌شوند و موم به حالت جامد در مي‌آيد.
PCR آشيانه‌اي
PCR آشيانه‌اي يكي از راههاي افزايش دقتPCR مي‌باشد. در اين روش از دو نوع پرايمر استفاده مي‌شود. ابتدا پرايمر اول اضافه مي‌شود و باعث تكثير قطعاتي ازDNAمي‌شود كه احتمال‌دارد به ميزان دلخواه اختصاصي نباشد سپس پرايمر دوم اضافه مي‌شود كه خصوصيات آن تكثيرقسمت داخلي‌تر يا بعبارت ديگر اختصاصي‌تر مي‌باشد.در واقع جفت پرايمر دوم پرايمرهائي هستند كه داخل جفت اوليه هستند و قطعات طويلتربوسيله اولين دورP CRتوليد مي‌شوند به عنوان يك الگو برايPCR دوم بكار مي‌روند.
اثر فلات
كاهش سودمندي تكثير و رسيدن به يك سطح ثابت تكثير در نتيجه كاهش مقدار آنزيم‌سيكل‌هاي بعدي را در اصط‌لاح اثر فلات در واكنش تكثيري گويند. اين فلات درPCR باTaq خيلي‌ديرتر از واكنش كه با آنزيم كلنو انجام مي‌شود تشكيل مي‌شود و بطوركلي اختصاصي بودن واكنش راافزايش مي‌دهد.
آلودگيهايPCR
در عملPCR بايد از تكثير آلوده‌كننده‌هايي مانندDNA هاي تكثير شده در آزمايشهاي قبل جلوگيري به عمل آيد. منابع زيادي براي آلودگيPCR وجود دارد كه در جدول زير آمده است
منابع بالقوه آلودگيPCR
هود و تهيه فيلترها، دستگاه الكتروفوژ، لوله‌هاي سانتريفوژ، وارد كردن نوك پپيت به ژل،ترموسايكلر، بلوك‌هاي حرارتي، روشهاي جمع‌آوري نمونه، آب يا سيستم خنك كننده، محيط آزمايشگاه، پرسنل آزمايشگاه، دستگاه هموژنيزه كننده بافت
منابع بالقوه آلودگي
براي جلوگيري از آلودگيPCR آزمايشات بايد در هود ويژه يا حداقل قسمتي از آزمايشگاه صرفا به اينكار اختصاص داده شده قرار گيرد. تجهيزات و محلولهائي كه مرتب درPCR كاربرد داردبايد تحت نگهداري ويژه باشد‌‌‌‌هر ماده كه قابل اتوكلاو كردن است بايد استريل شود و از دستكش در تمام مراحلPCR استفاده كرد و همچنين عينك و روپوش آزمايشگاهي نيز لازم است. محلولهائي مانند بافر وdNTP بايد در سيستمهاي بسته نگهداري شود و براي جلوگيري از آلودگي محلول پايه را بايد به چندقسمت تقسيم نمود. در ذيل بعضي از روشها كه مانع آلودگي مي‌شود ذكر شده است
- اوراسيل - ان - گليلوسيلاز (اين آنزيم محصولات قبليPCR را از بين مي‌برد
- اشعه ماوراء بنفش
- تيمار آنزيمي
- مدت زمان واسرشت شدن
- درجه حرارت واسرشت شدن
- تعداد چرخه
- استفاده ازdUTP به جايdTTP ،
روغنهاي معدني
روغنهاي معدني سبك براي پوشاندن مخلوطPCR و جلوگيري از تبخير به كار مي‌روند بطوركلي حدود 60-40 ميكروليتر از روغن به 100 ميكروليتر از محلولPCR اضافه مي‌شود روغن‌همچنين از آلودگي نمونه‌ها جلوگيري مي‌كند چنانكه سرپوش ترموسايكلر گرم شود احتياجي به‌پوشش با روغن نمي‌باشد روغن را با پيپت يا استخراج با كلروفورم براحتي مي‌توان خارج ساخت
منبع: آرش جوانمرد. بررسی چند شکلی ناحیه پروموتور ژن گیرنده هورمون رشد در گاوهای سیستانی. پایان نامه کارشناسی ارشد- دانشگاه تهران فارغ التحصیل رشته ژنتیک و اصلاح نژاد دانشگاه تهران
http://www.parsbiology.com/discuss/article.aspx?AID=69&TID=4
منبع: www.ake.blogfa.com منبع: www.ake.blogfa.com منبع: www.ake.blogfa.com